生物原子力显微镜在生物学研究中展现出独特优势，能够在近生理条件下观察生物样品的纳米级形貌与力学特性。对于初学者而言，样品制备是获得高质量AFM图像的关键第一步。本指南将系统介绍生物原子力显微镜样品制备的全流程。
一、核心原则与准备工作
生物AFM样品制备的核心原则是：保持样品天然状态、确保基底清洁平整、优化固定方法。实验前需准备：AFM专用云母片或玻璃基底、纯水与缓冲液、微量移液器、新鲜制备的生物样品（蛋白质、DNA、细胞或组织切片），以及适当的固定试剂（如戊二醛，浓度通常为0.1%-2%）。
二、分步制备流程
1.基底处理
云母片是常用基底，因其表面原子级平整且易于剥离出新表面。使用胶带剥离云母表层3-4次，暴露新鲜表面。若使用玻璃或硅片，则需依次用丙酮、乙醇和纯水超声清洗各10分钟，氮气吹干。
2.样品沉积
将1-10µL样品溶液（浓度建议：蛋白质0.01-0.1mg/mL，DNA1-5ng/µL）滴加在基底中央，室温静置吸附5-15分钟。吸附时间需优化：时间过短样品稀疏，过长可能形成多层聚集。
3.冲洗与固定
用30-50µL缓冲液（如PBS或Tris-HCl）轻柔冲洗表面3次，去除未吸附样品。注意冲洗角度应低于30°，避免直接冲击沉积区域。若需化学固定，滴加适量戊二醛溶液（常用0.1%）反应2-5分钟，随后用缓冲液冲洗。
4.液体模式准备
对于液体AFM成像（保持生物活性关键），在样品池中加入适量缓冲液全覆盖样品。避免气泡产生，轻轻倾斜样品池使液体自然流布。
三、关键技巧与常见问题
-浓度优化：初次实验建议设置浓度梯度，找到单分子分散与覆盖度的平衡点
-防污染：全程使用无尘手套、在洁净环境中操作，避免灰尘颗粒影响成像
-缓冲液选择：避免高盐浓度（通常<150mM），防止盐结晶干扰
-细胞样品特殊处理：需先用多聚赖氨酸处理基底增强细胞粘附，培养后轻柔冲洗
四、质量控制与上机前检查
制备完成后，先用光学显微镜检查样品分布均匀性。成功制备的样品应在AFM轻敲模式下呈现清晰、分散良好的结构。避免样品过度聚集或基底大面积空白。
